試讀20年12月14日新版《非洲豬瘟診斷技術(shù)》
發(fā)布日期：2021-05-14
國家標(biāo)準(zhǔn)即中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)簡稱國標(biāo) ，是指由國務(wù)院標(biāo)準(zhǔn)化行政主管部門或者其他有關(guān)主管部門對需要在全國范圍內(nèi)統(tǒng)一的技術(shù)要求制定的技術(shù)規(guī)范 。2020年12月14日國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會 ，2020年28號公告正式發(fā)布新版《非洲豬瘟診斷技術(shù)》國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18648-2020) ，代替GB/T 18648-2002 ，并于2020年12月14日正式實施 。
本標(biāo)準(zhǔn)的范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了非洲豬瘟的臨床診斷和實驗室診斷方法；臨床診斷依據(jù)臨床癥狀和病理變化 ，可初步判定為疑似非洲豬瘟病例 ，然后進(jìn)行實驗室診斷 ，對病例作出是否為非洲豬瘟的診斷 。本標(biāo)準(zhǔn)適用于家豬和野豬的診斷與監(jiān)測 ，并不適用于人 、其他動物 、植物以及飼料等 。
本標(biāo)準(zhǔn)的方法和商品化試劑
1、國標(biāo)“方法”是根據(jù)基礎(chǔ)技術(shù)和理論進(jìn)行比較 ，規(guī)定不同方法的檢測結(jié)果之間的判定優(yōu)先權(quán) ，與商品化試劑 、儀器設(shè)備 、工具 、人員無關(guān)。方法用于“檢測”，對臨床病例的“確診”需要綜合判定 。
2、CNAS認(rèn)可實驗室根據(jù)“檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則(ISO/IEC 17025:2017)”進(jìn)行檢測 ，應(yīng)使用“國際標(biāo)準(zhǔn)、區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)或國家標(biāo)準(zhǔn)”發(fā)布的方法 。
3、采用國標(biāo)方法開發(fā)生產(chǎn)的商品化試劑 ，可稱為國標(biāo)試劑 ；采用非國標(biāo)方法或者原理開發(fā)生產(chǎn)的商品化試劑，可稱為非標(biāo)試劑。
本標(biāo)準(zhǔn)中方法的分類
本標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的用于非洲豬瘟實驗室診斷的“方法 ”，從檢測靶標(biāo)物質(zhì)的分子水平上 ，可以分為三大類 ，即核酸檢測方法、病毒（完整顆粒）檢測方法和抗體檢測方法 。
考慮到生物安全和相關(guān)政策要求 ，本標(biāo)準(zhǔn)不支持病毒分離、培養(yǎng)和鑒定等基礎(chǔ)病毒學(xué)操作技術(shù)作為非洲豬瘟的診斷方法 ，亦未提供ASFV是否為活病毒 、是否具有感染力的檢測方法 。目前符合相關(guān)政策要求和生物安全要求 ，同時能夠滿足復(fù)養(yǎng)復(fù)產(chǎn)需要的方法是投放 “哨兵動物”，相當(dāng)于病毒學(xué)中的動物感染實驗 ，檢測環(huán)境中是否存在具有感染力的活的非洲豬瘟病毒顆粒 。
1、核酸檢測方法
普通PCR方法、熒光PCR方法和熒光RAA方法 ，檢測靶標(biāo)非洲豬瘟病毒的遺傳物質(zhì)即脫氧核糖核酸（DNA）的一段序列 ，可簡稱為核酸檢測（見標(biāo)準(zhǔn)7、8、9） 。
本標(biāo)準(zhǔn)中核酸檢測方法的檢測靶標(biāo)均為ASFV編碼P72蛋白基因即B646L ，且均給出了引物、探針等序列 ，擴(kuò)增片段位置和長度各不相同 ，見圖1 。
那么以檢測ASFV其它基因序列為靶標(biāo)的商品化試劑均為非標(biāo)試劑 。
圖1 核酸檢測方法檢測ASFV B646L的長度和相對位置
2、病毒（完整顆粒）檢測方法
高敏熒光免疫分析法和夾心ELISA抗原檢測法 ，檢測靶標(biāo)為完整的病毒顆粒 ，見圖2 ，可簡稱為病毒（完整顆粒）檢測（見標(biāo)準(zhǔn)10 、11） 。
圖2 左側(cè)為ASFV病毒超薄切片透射電鏡圖；右側(cè)為模式圖
3、抗體檢測方法
間接ELISA抗體檢測方法 、阻斷ELISA抗體檢測方法 、夾心ELISA抗體檢測方法和間接免疫熒光法 ，檢測靶標(biāo)為豬感染（或免疫）病毒后體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體 ，可簡稱為抗體檢測 。
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的抗體檢測方法又可分為全病毒特異性抗體檢測方法（見標(biāo)準(zhǔn)15，感染ASFV的細(xì)胞）和病毒單一結(jié)構(gòu)蛋白特異性抗體檢測方法（見標(biāo)準(zhǔn)12、13、14和15感染重組病毒（表達(dá)ASFV蛋白） 。
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體為P54、P30特異性抗體。
本標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果判定的等效性和優(yōu)先權(quán)
核酸、病毒（完整顆粒）和抗體三大類方法均可用于實驗室診斷 ，使ASFV的檢測國家標(biāo)準(zhǔn)更具有適用性 ，不同層級的實驗室可根據(jù)實際條件 、檢測需求和目的進(jìn)行選擇 ，同時在綜合判定（見標(biāo)準(zhǔn)16）中也依據(jù)不同檢測方法的最低檢出限規(guī)定了不同方法檢測結(jié)果之間的判定優(yōu)先權(quán)和終審權(quán) 。
核酸和病毒（完整顆粒）檢測方法均為陽性具有等效性：核酸檢測方法（普通PCR方法 、熒光PCR方法 、熒光RAA方法）和病毒檢測方法（高敏熒光免疫分析法 、夾心ELISA抗原檢測方法） ，任何一種方法檢測陽性的 ，可診斷為ASF病例 。
核酸和病毒（完整顆粒）檢測方法檢測結(jié)果不同時的判定優(yōu)先權(quán)：當(dāng)檢測結(jié)果不一致時 ，普通PCR方法 、高敏熒光免疫分析法和夾心ELISA抗原檢測法的任何一種的檢測陰性結(jié)果 ，必須服從于熒光PCR方法或熒光RAA方法任何一種陽性結(jié)果 ，可診斷為非洲豬瘟病毒感染 。
本項規(guī)定 ，主要是依據(jù)不同方法的檢測靈敏度確定 ，見圖3、4、5 。
圖3 普通PCR與熒光PCR方法最低檢出限的比較
熒光PCR檢測Ct值為31.78、36.89的樣品 ，用普通PCR方法擴(kuò)增后 ，在瓊脂糖凝膠電泳中幾乎很難看到相應(yīng)擴(kuò)增條帶 。
圖4 高敏免疫分析法與熒光PCR方法最低檢出限的比較
熒光PCR檢測Ct值為＜35的樣品 ，用高敏免疫分析法 ，可檢測判定為陽性 ；
熒光PCR檢測Ct值為＞35的樣品 ，用高敏免疫分析法 ，可檢測判定為陰性 。
圖5 熒光RAA方法與熒光PCR方法最低檢出限的比較
熒光RAA方法和熒光PCR方法 ，在本次實驗中檢測結(jié)果判定幾乎一致 。（圖3、4、5中的實驗數(shù)據(jù) ，受試劑的質(zhì)量 、樣品數(shù)量和質(zhì)量 、操作 、重復(fù)次數(shù)等因素影響和限制 ，不能完全反應(yīng)多種方法最低檢出限的相關(guān)性 ）。
抗體檢測方法的陽性判定具有等效性：間接ELISA抗體檢測方法、阻斷ELISA抗體檢測方法和夾心ELISA ，任一項檢測抗體陽性 ，可診斷為抗體陽性 。
ELISA方法檢測結(jié)果不同時的判定優(yōu)先權(quán)：三種ELISA抗體檢測方法的檢測結(jié)果不一致時 ，所有檢測結(jié)果服從間接免疫熒光方法 。
國家高新技術(shù)企業(yè)
農(nóng)業(yè)部GMP驗收企業(yè)
八項科技研發(fā)專利